Reaksi PCR

Berikut adalah komponen yang diperlukan untuk reaksi PCR, yaitu:

a.       DNA cetakan / DNA target

Merupakan keseluruhan DNA sampel yang di dalamnya terkandung fragmen DNA target. DNA cetakan yang digunakan sebaiknya berkisar antara 10⁵-10⁶ molekul dan sudah dimurnikan. DNA yang digunakan sebagai cetakan dapat berupa rantai-tunggal maupun rantai-ganda. Efisiensi amplifikasi biasanya lebih tinggi jika menggunakan molekul DNA yang sudah dilinearkan dengan enzim retriksi tertentu daripada kalau menggunkan molekul DNA berbentuk sirkular.

b.      Primer

Primer adalah suatu oligonukleotida yang memiliki 10 sampai 40 pb (pb = pasangan basa) dan merupakan komplementer dari DNA target. Pemilihan primer yang tidak sesuai dapat menyebabkan tidak terjadinya reaksi polimerasi antara gen target dengan primer. Berikut adalah kriteria pemilihan primer, yaitu :

1. Panjang primer : 15-30 pb

2. Kandungan GC sekitar 50%

3. Temperatur penempelan kedua primer tidak jauh berbeda

4. Urutan nukleotida yang sama harus dihindari

5. Tidak boleh terjadi self dimmer, pair dimmer, atau hairpin

c.       DNA Polimerase

Merupakan enzim yang stabil dalam pemanasan dan umumnya digunakan enzim Taq DNA polimerase (Taq = Thermus aquaticus). Enzim ini tetap stabil mengamplifikasi DNA walaupun amplifikasi berjalan pada suhu mendekati titik didih air.

d.      Buffer / Dapar

Buffer atau dapar yang digunakan umumnya mengandung MgCl₂ yang mempengaruhi stabilitas dan kerja enzim polimerase. Buffer yang dianjurkan untuk melakukan PCR adalah 10-50 mM Tris-HCL, pH 8,3-8,8 (pada suhu 20^oC). Untuk membatu proses penempelan primer dapat ditambahkan KCL sampai konsentrasi 50 mM dan tween 20 sebanyak 0,05-0,1% untuk mempertahankan kestabilan enzim Taq DNA polymerase.

e.       dNTP

dNTP atau deoxynukleotide Triphosphates merupakan suatu nukleotida bebas yang berperan dalam perpanjangan primer melalui pembentukkan pasangan basa dengan nukleotida dari DNA target. Larutan stok dNTP yang akan digunakan mempunyai pH 7,0 dan konsentrasi dNTP yang diperlukan dalam PCR berkisar antara 20-200 µM.